カンナビジオールは神経炎症反応と神経炎症回路を阻害します

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7907 (2023) この記事を引用

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5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

非多幸感をもたらす植物性カンナビノイド カンナビジオール (CBD) は、小児期発症のてんかんの治療に使用されて成功しています。 これらの状態は、発声学習を含む発達の遅れに関連しています。 キンカチョウのさえずりは、言語と同様、発達の敏感な時期に学習される複雑な行動です。 歌の品質は、学習と制作を制御する回路を含む継続的な感覚運動の洗練によって維持されます。 HVC は声の運動回路内にある皮質様の領域で、部分的に損傷を受けると一時的に歌の構造を破壊します。 私たちは以前、CBD（10mg/kg/日）が病変後の声の回復を改善することを発見しました。 現在の研究は、CBD音声保護に関与している可能性のあるメカニズムを理解し始めるために行われました。 私たちは、CBDが炎症性メディエーターと酸化ストレスマーカーの発現を著しく減少させることを発見しました。 これらの影響は、ミクログリア マーカー TMEM119 の局所的な発現低下と関連していました。 ミクログリアはシナプス再構成の重要な調節因子であるため、我々はシナプス密度を測定し、病変によって誘発される回路全体の有意な減少が、CBDによって大部分が逆転することを発見した。 シナプス保護には、NRF2活性化とBDNF/ARC/ARG3.1/MSK1発現が伴い、歌回路ノードの酸化ストレスの軽減とシナプス恒常性の促進に重要な機構が関与していることが示唆された。 私たちの発見は、CBDが複数の細胞シグナル伝達システムの調節と一致して一連の神経保護プロセスを促進することを実証し、これらのメカニズムが複雑な学習行動の損傷後の回復に重要であることを示唆しています。

大麻とそれが生成する生理活性分子の多くは、数十年にわたって研究されてきました1。 これらの努力の結果、何百もの植物カンナビノイドが同定され、その中で治療薬として際立っているのがカンナビジオール (CBD) とΔ9-テトラヒドロカンナビノール (THC) の 2 つです。 最近まで、CBD への関心は、より劇的な効果と多幸感を与える THC への注目によって覆い隠されていました。 小児発作障害を治療するために米国で植物由来の製剤の販売が承認されたため、より微妙に作用するCBDが現在、治療上の注目を集めています2。

これらの発作障害は言語発達の遅れと関連しています3。 小児てんかんの治験での管理人調査では、CBDが音声コミュニケーションを改善することが示唆されています4,5。 言語障害におけるCBDの潜在的な有用性を調査するために、我々は前臨床動物モデルとして音声学習鳴鳥であるキンカチョウを使用しました。

人間の言語と同様に、歌も発達の敏感な時期に学習されます6。 また、人間と同様に、鳴き鳥の音声学習は、皮質、線条体、視床の脳領域を結び付ける回路の確立に依存しています7。 遺伝子発現プロファイルは、鳴き鳥と人間の音声学習 8,9 および運動領域 10 の間に明確な類似性を示しています。 例えば、人間の喉頭運動皮質（LMC）層2、3、6と鳴き鳥のHVC（固有名詞）との間の機能的類似性を裏付ける証拠があり、それぞれが（LMC層5と鳴き鳥のアルコパリウムの堅牢な核からの）声の運動出力を駆動する[RA]。 、それぞれ9)。

以前、我々は、発声の質を混乱させるために両側HVC微小病変法を使用して11、10 mg/kgのCBDによる毎日の治療が歌の混乱の程度を減少させ、回復時間を改善することを発見しました12。 本研究では、動物への影響を軽減し、統計的に強力な被験者内制御を可能にするために、片側性病変アプローチを採用しました。 最初の結果は、両側法と同様に、片側の HVC 微小病変が歌のパターンを可逆的に破壊するが、その影響の程度はより控えめであることを示しました。 さらに、左半球の微小病変は右半球の微小病変よりも大きな声の混乱を引き起こすことがわかり、これは他の人によって報告された鳴き鳥の声の側方化と一致しています13。 回復は聴覚に依存するため（耳が聞こえない鳥は改善しない14）、大人の感覚運動の再学習が必要であることに注意してください。 私たちの現在の目標は、CBDが声質を保護し、複雑な運動動作の学習に依存した回復を改善するメカニズムの理解を深めることです。

蓄積されている証拠により、CBD には免疫細胞の活性化と CNS 損傷領域への遊走に関わる抗炎症作用と抗酸化ストレス作用があることが示されています 15。 例えば、マイクロアレイベースの遺伝子プロファイリングを使用した遺伝子発現研究では、CBDが炎症誘発性転写因子、サイトカイン、およびサイトカイン受容体（特にミクログリアによって放出され、マスター抗酸化調節因子によって制御される）の発現を調節することにより、いくつかの細胞事象を軽減することが示されています。 、NRF216、17）。 より最近の RNASeq 実験では、CBD によって変化した前頭前皮質における免疫メディエーターの発現と、ラット統合失調症モデルにおけるおそらく関連する認知機能の改善が実証されています 18。 アルツハイマー病マウスモデルでは、CBD は海馬の抗炎症作用を刺激し、恒常性オートファジー遺伝子発現を促進します19。 これらの抗炎症CBD活性の例を考慮すると、音声の回復にも同様のメカニズムが関与しているのではないかと考えられました。 この可能性の検証を開始するために、我々は、炎症性サイトカイン、神経酸化ストレスのマーカー、ミクログリア/マクロファージ浸潤、および関連する歌制御領域内のシナプス密度の関連する微小病変後の発現のCBD調節を調査しました（図1）。

歌脳の関心領域の概要。 (A) 焦点を当てた脳領域とその相互接続の概略図。 微小病変は HVC を標的とし、音声障害を引き起こし、回復は感覚運動学習に依存します (聴覚を失った鳥は回復しません 14)。 赤い矢印は、発声学習と成人期にわたる発声の変動の誘発に重要な皮質-大脳基底核-視床回路である前方前脳経路（AFP）を表します。 緑色の矢印は音声運動経路を表します。 破線の領域は、パネル B では表示されていない領域のおおよその X、Y 位置を示します。(B) は、関心領域のあるセクションを特定し、後で共焦点顕微鏡で取得した画像に重ね合わせるためにその境界を定義するために使用される代表的な暗視野画像です。 この画像は、パネル A のカメラ ルシダ タイプ トレースを作成するために使用されました。鳴き領域の明確な核構成が、層状の哺乳動物の皮質と対照的であり、損傷、解剖、およびその他の操作のターゲットを可能にすることに注目してください。 吻側はほぼ右、背側は上、バーは 1 mm です。 略語: HVC (固有名)、lMAN (前ニドパリウム外側大細胞核)、RA (アルコパリウムの堅牢な核)、Area X (線条体のエリア X、鳴き鳥線条体には解剖学的に区別する淡蒼球投射ニューロンと介在ニューロンも含まれることに注意してください)これらの特徴を分離する哺乳類の線条体からのものです20)。

他のシステムでは、CBD は抗炎症作用と抗酸化作用を示し、これが神経保護活性の一部を担っています 21,22。 CBDによる音声回復の改善に同様の抗炎症効果が関与しているかどうかを評価するために、いくつかの炎症誘発性メディエーターと抗炎症性メディエーターの発現を定量化しました（図2A〜D）。 マイクロパンチ解剖技術（後述）を使用して、微小病変の24時間後に組織を分離し、運動節（HVCおよびRA）内の歌領域からRNA抽出、cDNA合成および増幅を行い、必須回路を学習しました（エリアX、マイクロパンチ解剖に注意してください）使用されるアプローチは補足図S2に示されています）。 混合モデルのＡＮＯＶＡにより、ＣＢＤ治療は、炎症促進性メディエーターＩＬ－６（ＨＶＣ内で平均＝０．６１５［０．２４３～０．９８７］、ｐ＝０．０００２；ＩＬ－１β（ＨＶＣ内で平均））の発現倍数（媒体対照と比較して）が有意に減少したことを明らかにした。 = 1.33 [0.427–2.222]、p = 0.0015; 平均値による RA = 1.44 [0.542–2.337]、p = 0.0005; 平均値による RA = 0.563 [0.192–0.935]、p = 0.0008; 平均値による面積 X = 0.435 [0.063–0.807]、p = 0.0141、図 2A–C を参照）病変領域、HVC および RA では、TNFα 発現のさらなる減少が示されました（HVC 平均 0.275 [0.087–0.462]、p = 0.0016、RA 平均 = 0.292 [0.105–0.48]、p = 0.0008)、エリア X では統計的に有意ではありませんでした (平均 = 0.035 [− 0.222–0.153]、p = 0.960)炎症誘発性メディエーターの発現を減少させることに加えて、CBD は抗炎症性サイトカイン IL-1023 を上方制御することも示されており、IL-10 発現の違いを定量化したところ、CBD 投与鳥の HVC ではそれらが有意に増加していることがわかりました (平均 = 0.512 [0.152–0.872、p = 0.0023)および RA (平均 = 0.487 [0.127–0.846]、p = 0.004) ですが、X 領域にはありません (平均 = 0.008 [− 0.368–0.352]、p > 0.99、図 2D を参照)。

CBD は、抗炎症および抗酸化ストレス関連遺伝子発現のパターンを促進します。 発声運動 (HVC および RA) と学習回路 (領域 X) の両方の脳領域をマイクロパンチで解剖し、全 RNA を抽出し、cDNA を合成し、PCR 増幅しました。 IL-1B、IL-6、IL-10、TNFα、およびSOD2の遺伝子発現を内因性対照(GAPDH)に対して正規化し、損傷のない半球からの変化倍数を2-ΔΔCTとして表した。 定量化するために、グループあたり n = 5 の cDNA を 3 回増幅し、平均サイクル閾値 (Ct) 値を計算しました。 次に、平均 Ct 値をさらなる分析に使用しました。 (A) CBD は、HVC、RA、およびエリア X における炎症誘発性 IL-6 の平均発現倍数を有意に減少させました。(B) CBD は、HVC および RA における IL-1B の平均発現倍数を減少させましたが、エリア X では減少させませんでした。(C) TNFα HVC および RA では減少しましたが、X 領域では減少しませんでした。(D) 抗炎症性メディエーター IL-10 の平均発現倍数は、HVC および RA では増加しましたが、X 領域では有意ではありませんでした。(E) 酸化ストレスのマーカーの発現、スーパーオキシドジスムターゼ 2 (SOD2) は HVC および RA 内で減少しました。 組織は損傷後 24 時間で採取されており、損傷後の時間とともに変化することが知られている炎症性サイトカイン発現の「スナップショット」を表していることに注意してください 24。 グループの差異は、Sidak の多重比較補正を使用した混合モデル ANOVA によって評価されました。

抗炎症効果と一致して、CBD は直接的および間接的な抗酸化活性の両方を通じて酸化還元バランスに影響を与えることが示されています25。 スーパーオキシド副産物の結合に関与するミトコンドリアタンパク質SOD2をコードする遺伝子であるスーパーオキシドジスムターゼ2（SOD2）の発現は、HVC内でCBD関連の有意な減少を示しました（平均倍数 = 0.8768 [0.269-1.49]、p = 0.002）。および RA (平均倍率 = 0.701 [0.093–1.31]、p = 0.018) でしたが、X 領域ではありません (平均倍率 = 0.4841 [- 0.124–1.092]、p = 0.162、図 2E を参照)。

SOD2 発現の低下が酸化ストレスの一般的な低下を伴うことを確認するために、スーパーオキシド指示薬ジヒドロエチジウム (DHE、図 3 を参照) を使用しました。 酸化されると、DHE は二本鎖ゲノム DNA に挿入され、赤色蛍光で核をマーキングします。 溶媒グループでは、微小病変により、HVC 内の DHE 染色の補正全細胞蛍光 (CTCF) (平均 = 52,215 [26,635 ～ 77,796]、p < 0.0001)、RA (49,460 [23,880 ～ 75,041]、p < 0.0001) が有意に増加することがわかりました。 )、およびエリア X (29,817 [4237–55,397] による、p = 0.0152、図 3A を参照)。 対照的に、ビヒクル処置動物とCBD処置動物の非病変半球間には、DHE染色に有意差はなかった（図3B、損傷のないVEHと損傷のないCBD 3a、b、e、f、I、j）。 (HVC、平均値 = 1777 [23,803–27,358]、p > 0.9999; RA、平均値 = 2194 [－ 27,775–23386]、p > 0.9999; および面積 X、平均値 = 4280 [－ 21,300–29,861]、p = 0.9980)。 ビヒクル処置動物とCBD処置動物の損傷半球内のDHE染色を比較すると、CBDはHVC内の強度を低下させた（平均= 33,153 [7573～58,734]、p = 0.0056）、RA（平均= 30,998 [5417～56,578]、p = 0.0107）、および面積 X（平均 = 28,089 [2508–53,669]、p = 0.0250、図 3B を参照）。 さらに、治療群をそれぞれの非病変対照と比較した場合、CBD治療はすべての領域でDHE発現の病変に関連した変化を有意に減少させました（HVCの平均値 = 181.5% [53.91-309.1]、p = 0.0045; RAの平均値 = 143.6% [16.04 -271.2]、p = 0.0248、面積 X の平均値 = 152.0% [24.40-279.6]、p = 0.0171 図 3C を参照)。

CBD は、ジヒドロエチジウム染色 (DHE、赤色) の強度で示されるように、損傷を受けた半球の活性酸素種を減少させました。 (A) 病変の状態と治療の関数として活性酸素種 (ROS) を示す局所 DHE 染色を表示する代表的な共焦点画像。 (B) 直径 0.5 mm の円形領域を使用した、各領域内の DHE 染色の平均補正全細胞蛍光 (CTCF) の概要 (CTCF 計算の詳細については方法を参照)。 ビヒクル群では、微小病変により、HVC、RA、およびエリア X 内の DHE 染色の総蛍光が有意に増加しました。CBD 治療群では、病変誘発 DHE 染色の有意な増加は観察されませんでした。 病変のある半球のすべての脳領域において、CBD治療群では対照と比較してDHE染色が有意に低かった。 (C) ビヒクル処理動物および CBD 処理動物の病変半球内の DHE 染色の対照変換測定値 (%) を比較すると、CBD は HVC、RA、および X 領域内の強度を減少させました。CBD 処理は、すべての領域で DHE 発現の病変関連変化を有意に減少させました。それぞれの制御半球の割合。 平均グレー値を決定し、調査した各歌領域の外側の平均強度を使用して背景蛍光を補正しました。 比較を行い、混合モデル分散分析後の多重比較の Sidak 補正を使用して有意性を決定しました (グループあたり n = 4)。

CBD によって誘導される遺伝子発現の抗炎症および抗酸化パターンが機能的タンパク質レベルの変化をもたらすことを確認するために、免疫蛍光アプローチを使用しました。 IL-6、IL-1B、およびIL-10を標的とする抗体を使用して相対免疫蛍光を測定し、結果を損傷のない半球の割合として表しました（図4A〜F、使用した抗体の選択性は、予想される単一の主要なバンドの染色によって裏付けられていることに注意してください）サイズ: 補足図 S6 を参照)。 CBD は、HVC（平均パーセント = 128.9% [62.32-195.4]、p = 0.0001）および RA（89.37% [22.84-155.9]、p = 0.0063）における病変関連 IL-6 タンパク質発現を有意に減少させました。図 4A、 B)。 IL-1Bの場合、CBD治療はHVC（平均= 131.2% [53.55-208.8]、p = 0.0007）およびRA（平均= 115.0% [37.36-192.6]、p = 0.0026、図4C）における発現を有意に減少させた。 、D）。 IL-1B ではなく IL-6 の発現は、X 領域で差次的に調節されました (IL-6 は 72.21% [5.679-138.7]、p = 0.031、IL-1B は 1.44% [- 76.17-79.04]、p) > 0.9999、図 4B、D)。 CBDは、RA（平均= 54.9% [9.388-100.4]、p = 0.0147）およびX領域（平均= 66.5% [20.96-111.9]、p = 0.0030）の抗炎症性IL-10を有意に増加させましたが、CBDはありませんでした。病変部位の統計的差異（平均HVC = 21.4% [- 66.85–24.14]、p = 0.5612、図4E、F）。

CBD は炎症に関連するサイトカイン密度を変化させます。 10 mg/kg による毎日の治療は、片側 HVC 病変から 24 時間後の IL-1B、IL-6、および IL-10 タンパク質発現の調節と関連していました。 運動領域 (HVC & RA) および学習必須領域 (Area X) 内の IL-1β、IL-6、および IL-10 を標的とした抗体染色の代表的な免疫蛍光共焦点画像を示します。 (Aa〜Al)、ビヒクル処理鳥とCBD処理鳥におけるIL-6の代表的な局所分布を示す損傷した半球画像。 (Ca – Cl)、IL-1B の地域分布を示す画像。 (Ea〜El)、IL-10の局所的分布を示す共焦点画像。 損傷のない半球の代表的な画像を補足図S3に示します。 B、歌領域および薬物治療による、損傷のない対照半球からのパーセント変化としてのIL-6蛍光。 CBD は、HVC、RA、および X 領域における IL-6 発現を有意に減少させました。D、歌領域および薬物治療による、病変のない対照半球からの変化率としての IL-1B 蛍光。 CBD は、HVC および RA における IL-1B 強度を大幅に減少させました。 F、歌領域および薬物治療による、非病変対照半球からの変化率としての抗炎症性IL-10蛍光。 CBD は、RA および X 領域における IL-10 強度を有意に増加させました。差異は、混合モデル ANOVA とそれに続く Sidak 補正後の比較によって決定されました。 Image J ソフトウェアを使用して、最大強度で投影された Z スタック画像を分析し、グループあたり n = 5 のすべての画像にしきい値を一貫して適用しました。

CBD の抗炎症作用および抗酸化作用は、ホメオスタシスを維持するために、NRF2 を介した酸化還元、ミトコンドリアおよび炎症プロセスの調節に関与していることを示唆しています。 結果は、CBD治療がすべての対象領域内でpNRF2の核レベルを有意に増加させたことを示しています：HVC（平均パーセント = 19.6 [3.7-35.4]、p = 0.0259）、RA（平均 = 11.65 [2.39-20.9]、p = 0.0262） ）および面積 X（平均 = 7.1 [1.8–12.43]、p = 0.0218、図 5B）。

CBD は、抗酸化反応を調節する転写因子 pNRF2 の核局在を増加させます。 (A)、歌領域内の画像は、片側 HVC 病変の 24 時間後に採取された組織から撮影されました。 上の行(af)はpNRF2染色です。 下の行(gl)は、赤色のpNRF2染色と青色のヘキスト核染色を組み合わせたものである。 (B)、対象の歌領域における pNRF2 核染色を、総核染色のパーセンテージとして表します。 結果は、CBD治療が抗酸化反応と一致して、HVC、RAおよびエリアX内の核pNRF2を有意に増加させたことを示しています。 Image J ソフトウェアを使用して、最大強度で投影された Z スタック画像を分析し、しきい値をすべての画像に一貫して適用しました。 グループ間の差異は、混合モデル ANOVA とそれに続く Sidak 補正後のグループあたり n = 4 の事後比較を使用して決定されました。

ミクログリアの活性化、リクルート、および食作用は損傷後の主要な炎症反応であり、補体カスケードに対する下流の影響を伴うサイトカインの放出とスーパーオキシド生成によって媒介されることが知られています 26,27。 これまでの証拠は、ミクログリアの活性化と、組織損傷中の神経細胞死のピーク時に観察される炎症誘発性遺伝子（すなわち、IL-1B および IL-6）の一過性の上昇とを関連付けています 27。 微小病変手術後 24 時間で炎症誘発性サイトカインの発現増加が示された結果を考慮して、私たちのシステムにおける CBD の作用機序の一部としてミクログリアが関与している可能性を検討しました。 ミクログリアマーカーとしてTMEM119を使用して、歌領域（HVC、RA、およびエリアX）内の病変誘発TMEM119染色とこの発現に対するCBDの影響を研究しました（図6A）。 結果は、HVC、RA、およびエリア X 内で、CBD 処置動物の TMEM119 レベルが対照と比較して有意に低かったことを示しています（平均 97.61% [27.59-167.6]、p = 0.0053; 103.8% [33.77-173.8]、p = 0.0031、および; 87.39% [17.37-157.4]、p = 0.0123、それぞれ (図 6B).ミクログリアに対する我々の現在の焦点は最初のステップを表しており、微小病変誘発性炎症反応における他の細胞型の関与の可能性を排除するものではないことに注意してください(例：反応性アストロサイト）28。

CBD治療は、損傷した半球の歌領域内のミクログリアマーカーTMEM119の密度を減少させます。 (aa-af)、TMEM119 免疫蛍光はミクログリアをマークし、ビヒクル処理 HVC、RA、およびエリア X に高密度の蛍光が存在します。CBD 処理グループでは TMEM119 染色が低いことが明らかです。 (ag-al)、TMEM119 とヘキスト染色された核の画像をマージします。 (b) TMEM119 密度は、損傷のない半球のパーセンテージとしてヘキスト染色に対する TMEM119 平均グレー値として表されます。 HVC、RA、およびエリア X 内では、TMEM119 密度は、ビヒクル対照と比較して、CBD 処置動物で有意に低かった。 グループ間の差異は、混合モデル ANOVA とそれに続く Sidak 補正後のグループあたり n = 4 の事後比較を使用して決定されました。

重要なミクログリアの機能には、神経変性後の軸索およびシナプス残骸の貪食作用による除去が含まれます29。 CBDに関連してミクログリアのTMEM119発現が減少したという証拠により、治療がシナプス密度も保護するかどうかという疑問が生じました。 これを測定するために、シナプス前および後シナプスマーカーである VGLUT2 と PSD-95 の共局在を治療群間で比較しました (図 7、8、9、10)。 病変に関連したシナプス密度の大幅な減少が見られました。 ビヒクル群では、片側の微小病変により、HVC内のシナプス密度が減少しました（図10、損傷のないVeh vs 損傷のあるVeh）平均= 0.20/μm2 [0.025-0.38]、p = 0.0272）、RAの平均= 0.24/μm2 [0.11 –0.37、p = 0.0014)、面積 X の平均値 = 0.16/µm2 [0.007–0.31]、p = 0.0410)。 興味深いことに、CBD グループの RA 内では、病変後のシナプス密度の有意な減少が見られました (病変のない CBD と病変のある CBD の平均 = 0.16/μm2 [0.022-0.30]、p = 0.0234)、HVC およびエリア X の変化は有意ではありませんでした。 ただし、CBD治療は、HVCにおけるビヒクルと比較して、RAにおける病変後のシナプス密度に重大な影響を及ぼしました（Veh病変対CBD病変、平均= 0.19/μm2 [0.002-0.38]、p = 0.0476）（平均= 0.18/μm2） [0.05–0.32]、p = 0.0088、および面積 X (平均 = 0.15/μm2 [0.04–0.26]、p = 0.0122)CBD 治療はまた、HVC 内の病変に関連した減少を逆転させるようでした (病変のない CBD vs 病変のある CBD、平均= 0.076/μm2 [− 0.1126–0.2654]、p = 0.7154、および面積 X (平均 = 0.094/μm2 [− 0.019–0.21]、p = 0.1094) ですが、RA では依然として顕著な減少が見られました (平均 = 0.16/μm2 [0.022– 0.30]、p = 0.0234）その後、我々は、損傷のない半球と損傷のある半球とのシナプス密度の差を、損傷のない対照半球のパーセンテージとして共局在する点の数として定量化した（図10B）。病変後のシナプス密度の有意な増加（HVC 平均 = 24.4% [0.4095-48.41]、p = 0.0.0464; RA 平均 = 16.5% [3.019-29.90]、p = 0.0186）、面積 X には差がありませんでした。有意 (平均 = 13.77% [12.02–39.56]、p = 0.3336)。 有意であるとは判明していないが、CBD治療がビヒクルと比較して非損傷半球のシナプス密度を増加させる傾向があることは重要であり、これは損傷の保護に加えてシナプス形成の促進を示唆している(図10A)。

CBD 治療は、HVC 内の病変に関連した損失からグルタミン酸作動性シナプス密度を保護します。 （ a – t ）4つのグループのシナプス密度を示す免疫蛍光の代表的な共焦点画像：VEH損傷なし（a – e）、CBD損傷なし（f – j）、VEH損傷あり（k – o）、およびCBD損傷あり（p – t）。 染色は、Hoechst、PSD95 (シナプス後マーカー)、および VGLUT2 (シナプス前マーカー) の列にそれぞれ分割されています。 列 4 は PSD95 と VGLUT2 のマージであり、列 5 は共局在する涙点のマスクを示しています。 シナプスマスクは、VEH 対照と比較して、CBD グループが病変後 24 時間でグルタミン酸作動性シナプス密度が著しく高いことを示しています。

CBD 治療は、関節リウマチ内の病変に関連した損失からグルタミン酸作動性シナプス密度を保護します。 （ a – t ）4つのグループのシナプス密度を示す免疫蛍光の代表的な共焦点画像：VEH損傷なし（a – e）、CBD損傷なし（f – j）、VEH損傷あり（k – o）、およびCBD損傷あり（p – t）。 染色は、Hoechst、PSD95 (シナプス後マーカー)、および VGLUT2 (シナプス前マーカー) の列にそれぞれ分割されています。 列 4 は 2 つの染色を組み合わせたもので、列 5 は PSD95 と VGLUT2 の共局在涙点のマスクを示しています。 シナプス マスクは、VEH コントロールと比較して、CBD グループのグルタミン酸作動性シナプス密度が病変後 24 時間で有意に高いことを示しています。

CBD 治療は、領域 X 内の病変に関連した損失からグルタミン酸作動性シナプス密度を保護します。AT、4 つのグループのシナプス密度を示す免疫蛍光の代表的な共焦点画像: VEH 非損傷 (a-e)、CBD 非損傷 (f-j)、VEH 損傷 (k- o)、および CBD 損傷 (p–t)。 染色は、Hoechst、PSD95 (シナプス後マーカー)、および VGLUT2 (シナプス前マーカー) の列にそれぞれ分割されています。 列 4 は 2 つの染色をマージしたもので、列 5 は PSD95 と VGLUT2 の共局在涙点のマスクを示しています。 シナプスマスクは、VEH 対照と比較して、CBD グループが病変後 24 時間でグルタミン酸作動性シナプス密度が著しく高いことを示しています。

CBD 治療は、グルタミン酸作動性シナプス密度を病変に関連した損失から保護します。 （a）ビヒクルおよびCBDで処理した鳴き鳥の損傷のない半球および損傷のある半球内の鳴き領域のシナプス密度の定量化。 ビヒクル群では、片側の微小病変により、調べた 3 つの領域 (HVC、RA、X 領域) のすべてでシナプス密度が減少しました。 逆に、CBD グループでは、HVC またはエリア X に重大な損傷効果はありませんでした。この保護は、欠損は減少しましたが、RA ではそれほど強力ではありませんでした。 CBD 治療は、対象となる 3 つの領域すべてにおいて、ビヒクルで治療された鳥の病変後のシナプス密度と比較して、病変後のシナプス密度に重大な影響を及ぼしました。 (b) 病変に関連したシナプス密度の変化は、病変のない対照半球のパーセンテージに変換された共局在点として表されます。 HVC および RA 内では、CBD グループでは病変後のシナプス密度が大幅に増加しましたが、エリア X には大きな差はありませんでした。 これは、音声生成の重要な領域でシナプスが大幅に保護されていることを示しています。 分析のために、各 Z スタック画像セットは後処理され、最大強度で投影されました。 各領域内に共局在する VGLUT-2 と PSD-95 の点を、グループあたり n = 5 匹の動物から適用した閾値を使用して粒子分析用に定義しました。 次いで、グルタミン酸作動性シナプス密度を、損傷のない対照半球からの変化パーセントとして定量化した。 多重比較のための Sidak 補正を備えた混合モデル ANOVA を使用して、有意性が評価され、適切な比較が行われました。

キンカチョウの声の回復には感覚運動フィードバックが必要です14。これにより、経験と神経可塑性および恒常性シナプススケーリングを結び付ける要因を調査することになりました30。 qRT-PCR を介して主要な可塑性関連遺伝子の発現を定量化することにより、BDNF (F[3, 36] = 28.79、p < 0.0001)、MSK1 (F[3, 36] = 57.63、p < 0.0001）および ARC/ARG3.1（F[3, 36] = 46.53、p < 0.0001、図 11）。

CBD はシナプススケーリング制御因子の発現に影響を与えます。 Y 軸 = BDNF、ARC/ARG3.1、および MSK1 の mRNA 発現をハウスキーピング コントロール (GAPDH) に対して正規化し、病変のない半球からの倍率変化 (2 − ΔΔ CT) として表します。 n = 4 人の被験者のグループから合成された cDNA サンプルを 3 回増幅し、平均をプロットしました。 (a) 損傷した半球のRAおよび領域Xでは、CBDはVEH対照と比較してBDNFの平均発現倍数を有意に増加させた。 (b) HVC、RAおよび病変半球のX領域では、CBD治療によりMSK1の平均発現がVEHよりも増加しました。 (c) RAおよび病変半球のX領域では、CBDはVEHと比較してARC/ARG3.1発現を抑制した。 グループの差異は、Sidak の多重比較補正を使用した混合モデル ANOVA によって評価されました。

事後比較により、ＶＥＨ対照病変では、ＨＶＣにおけるＢＤＮＦ発現が有意に増加したが（１．２９倍、９５％ＣＩ＝０．６６〜１．９２、ｐ＜０．０００１）、ＲＡまたはエリアＸでは増加しなかったことが明らかになった（図１１Ａ）。 これは、損傷領域である HVC における BDNF 発現の刺激に関連しているようですが、その投影ターゲットである RA およびエリア X には及ばなかったのです。 これは、損傷のないグループと損傷グループの鳥の間で有意な差があった CBD 処理フィンチでは当てはまりませんでした。各脳領域で観察されました (HVC では 1.15、95% CI = 0.52 ～ 1.78、p < 0.0001; RA では 1.01、95% CI = 0.38 ～ 1.64、p = 0.0007; X 領域では 1.02、95% CI = 0.39–1.36、p = 0.0006)。

BDNF が経験関連シナプス可塑性における MSK1 発現を増加させるという証拠があるため 31、我々はこのキナーゼ発現の潜在的な CBD 制御を調査しました。 VEH 対照では病変により MSK1 発現が増加する傾向がありましたが、これは領域 X でのみ有意に異なりました (病変のない VEH と病変のある VEH で 0.68、95% CI = 0.24 ～ 1.11、p = 0.0010、図 11B)。 対照的に、CBDで治療した鳥では、各脳の関心領域でMSK1発現が有意に増加しました（HVCでは1.25、95% CI = 0.81～1.66、p < 0.0001; RAでは1.08、95% CI = 0.64～1.52、p < 0.0001; エリア X では 1.01、95% CI = 0.38 ～ 1.64、p < 0.0001)。

恒常性シナプススケーリングのモデルでは、高レベルのシナプス活性により BDNF/MSK1 経路 32 のシグナル伝達が増加し、ARC/ARG3.1 発現が促進されます。 ARC/ARG3.1 活性は興奮性 AMPA 受容体の内部移行を促進し、興奮性シナプス強度を低下させます。 このARC/ARG3.1シグナル伝達経路が我々のシステムにおけるCBD治療によって影響を受けるかどうかをテストするために、ARC/ARG3.1発現に対する治療効果を測定しました。 興味深いことに、ビヒクル処理対照の各脳関心領域では、病変により ARC/ARG3.1 発現が有意に増加しました（HVC では 0.08、95% CI = - 0.40 ～ 0.56、p = 0.970; RA では 0.56、95% CI = 0.079–1.04、p = 0.017; エリア X では 0.62、95% CI = 0.14–1.11、p = 0.0068、図 11C)。 ビヒクルとCBDで治療した損傷鳥を比較すると、CBDで治療したフィンチのARC/ARG3.1の発現はRAおよびエリアXで有意に低かったが、HVCではそうではなかった（RAでは0.56、95％CI = 0.08〜1.04、p） = 0.017 および; 面積 X by 0.62、95% CI = 0.14–1.11、p = 0.007)。 他のシステムと同様に、ARC/ARG3.1 が AMPA 受容体を内部に取り込むように作用する場合、CBD 治療後の濃度の向上が期待できます。 現在、この可能性を調査中です。

これらの実験は、以前に観察されたHVC微小病変後の声の回復のCBD加速に寄与する可能性のある候補メカニズムを特定するために行われました。 そして、関与する学習領域と運動領域を特定し始めます。 鳴き鳥の CBD 神経保護を研究する価値は、声の学習と生成を制御する回路の個別のノード内で変更されたプロセスを特定できることにあります。 鳴き鳥と人間の両方の音声制御経路は、非音声学習種と比較して翻訳関連性を高める収束的な機能的類似性を共有しています9,10。 鳥類とヒトの音声経路の明確な違いは、頭部音声制御領域の積層構造ではなく核構造であることです。 この違いにより、操作や空間評価の対象となる領域に利点がもたらされます。 私たちが活用した機能です。 HVC (運動前皮質様微小病変ターゲット) に加えて、我々はその投影ターゲットである RA (運動皮質様) と、 エリア X (淡蒼球投射ニューロンも組み込まれた学習に不可欠な線条体領域)。 歌の回復は聴覚に依存する感覚運動統合に依存するため（聴覚障害のある鳥は改善しない14）、私たちのシステムは、成人の喪失と学習に依存した複雑な運動スキルの回復を独自にモデル化します。

結果は、HVC 微小病変モデルにおいて、CBD が哺乳動物系でよく特徴付けられている効果と一致する強力な抗神経炎症効果を有することを示しています 16 (図 2 および 4 を参照)。 神経炎症はさまざまな CNS 障害の発症における病因であるため、これは重要です 33。 一例は、気分障害や若年性認知症の可能性を高める、外傷後の脳損傷によって引き起こされる慢性神経炎症です。 慢性神経炎症の治療に必要な長期投与を考慮すると、現在の治療法では重大な副作用や有効性の低下が一般的です 35。 私たちや他の人々がCBDを使用して観察した深い抗神経炎症効果は、好ましい副作用プロファイルの証拠と組み合わせると36、CBDがこの困難な状態を管理する能力を向上させる可能性があることを示唆しています。

CBDを治療に使用する場合の潜在的な問題は、選択性の欠如です。 この薬剤は、複数の細胞標的と相互作用し、その活性を修飾します 37,38。 さらなる問題は、他の潜在的に生物活性のある分子の同時単離です。 精製されたCBD抽出物には、CNS活性THC39を含む他のカンナビノイドが少なくとも微量含まれています。 私たちは、CBDの有効性がTHC含有量によって影響を受けることを発見し、一貫して注意深く管理された配合の重要性を強調しています40。 CBD治療の影響を受ける経路を特定することで、より選択的な薬剤を特定し、潜在的なオフターゲット効果を軽減できる可能性があります。 あるいは、CBD の多様な細胞相互作用の取り巻きが有効性の鍵であり、神経保護に必要である可能性があります。 微小病変モデルは、抗神経炎症機構の特定と潜在的な新薬のスクリーニングに有望であることが示されています。

CBD の抗炎症効果は、微小病変領域、HVC で最大であるように見えましたが、RA およびエリア X 内では徐々にその程度は小さくなりました (例、図 2A ～ C)。 これはHVCへの近接性と一致しており、長い突起に先立つ短い変性突起への予想される影響と一致しています（補足図7のこれに関する第二銅銀染色の証拠に注目してください）。 RA は、X 領域に関連する前方前脳学習経路 (AFP) と後部運動経路 (HVC 経由、図 1 を参照) の両方からの出力を統合するため、AFP 学習回路の入力に先立って運動入力が中断されることが予想されました。 AFP は、感覚運動学習に重要な音声変動を導入し、RA42 と HVC の両方の活動を（中脳ドーパミン作動性核を介して間接的に 43）調節するエラー生成機能を備えています。 HVC モーター制御が低下した条件下での AFP エラー生成の持続は、微小病変による音声の中断と一致します。 これは、AFP 欠損鳥において微小病変の影響が最小限しか観察されない理由を説明する可能性があります 11。

抗炎症反応性の地域差のもう 1 つの潜在的な説明は、多くの場合調整され、連続的に行われるこれらのプロセスのタイミングです 44。 調査したのは 24 時間の 1 つの時点だけであるため、反応が始まったばかりなのか、終わったばかりなのか、あるいはピーク規模にあるのかはわかりません。

同定された2番目のメカニズムには、HVCおよびRA内のSOD2発現に対する影響によって示されるように、酸化ストレスのCBD緩和が含まれます（図2E）。 酸化ストレスの影響は、スーパーオキシド活性化 DHE 染色の減少によってさらに確認されました 45 (図 3)。 サイトカインと同様に、スーパーオキシド生成の大きさは病変の近さによって異なりますが、HVCおよびRAではCBDによって大幅に減少しました（図3B）。 DHE 蛍光の局所的な測定値は周囲の領域と比較して表現されるため、歌回路内の選択的な効果を示すことに注意してください。

CBD の抗炎症作用と抗酸化作用の組み合わせは、高次の組織化されたストレス反応の関与を示唆しています。 これと一致するのは、酸化還元、ミトコンドリアおよび炎症メディエーターの確立された中心調節因子であるNRF2によって制御されるシグナル伝達です。 基本条件下では、NRF2 は酸化ストレスを受けるとリン酸化によって活性化される細胞質タンパク質です 17。 活性化されたホスホNRF2は核に移行し、そこで抗酸化物質、オートファジー、ミスフォールドタンパク質、その他の細胞反応に関与する多数の遺伝子を制御する転写因子として機能します46。 私たちのシステムで観察された核ホスホ-NRF2のCBD関連の顕著な増加（図5を参照）は、この恒常性経路が私たちのモデルに関与していることを示しています。 CBD は以下の両方を効果的に行うという事実: (1) 通常 NRF2 を活性化する酸化ストレスを軽減する。 (2) pNRF2 の核移行の増加は、CBD の抗酸化活性が pNRF2 活性化の下流にあること、または CBD が活性酸素種の減少にもかかわらず NRF2 を活性化できること (または両方の可能性の組み合わせ) を示唆しています。 このシステムにおけるNRF2シグナル伝達の性質を明らかにするには、CBDの時間依存性の効果を調査する追加の実験が必要である。 NRF2 シグナル伝達の他の活性化剤は臨床的に関連のある抗炎症剤であることに注意してください 47。 NRF2 は、植物由来の抗酸化物質スルフォラファンによっても強力に活性化されます。スルフォラファンの誘導体は現在、CNS 出血で評価されています 48。 これらのより選択的な薬剤は、HVC 微小病変系における抗神経炎症評価の候補です。

微小病変後に観察される炎症促進性サイトカイン発現の種類（上記）は、他のシステムでは、ミクログリアの活性化、浸潤、および細胞残骸の貪食に関連しています。 これらの活動は、アポトーシスに対するニューロンの回復にとって非常に重要である可能性があります26。 これにより、HVC 微小病変と CBD による音声回復の改善後の潜在的なミクログリア関連活動を調査することができました。 ミクログリアの関与に関するこの調査は最初の最初のステップであることに注意してください。 他の細胞タイプが病変誘発炎症とCBDの抗炎症活性の両方に関与している可能性が非常に高いです（例：反応性星状細胞）28。 追加のマーカーを使用した実験が現在計画されており、その結果、私たちのシステムで活動し、それに関連する細胞タイプのより完全な特性評価が得られるでしょう。

現在、ミクログリアマーカーとしてTMEM119を使用して49、CBDが骨髄細胞浸潤の減少と一致して染色濃度を大幅に減少させることを発見しました（図6A、B）。 これは、我々が調査した最初の24時間の単一の時点での損傷誘発性骨髄細胞活性が、神経保護ではなく微小病変の破壊的効果と関連していることを示唆しているので興味深い。 病変形成後 24 時間の TMEM119 染色細胞の丸い細胞外観は、微小病変が活性化食作用状態でミクログリアの密度を増加させ、CBD 治療がこれを減少させることを示唆していますが、証明はしていません (図 6Aa-b に示すように)。 今後は、病変への影響のより完全な時間経過を調査することが重要になります。 もう一つの警告は、TMEM119 がこれまで考えられていたほど確実にミクログリアと移動する末梢マクロファージを区別できない可能性があり、活性化状態と不活性化状態を区別しないことを示唆する最近の証拠に続くものである50。 ミクログリアは、炎症促進性の「M1 様」から抗炎症性の「M2 様」サブタイプまで、一連の活性化状態をとる可能性があるため 51、将来の研究では、骨髄細胞応答の種類と活性を区別するために複数のマーカーを測定することが重要になるでしょう 50 、52。 他のCBD関連の測定とは異なり、病変によって増加したTMEM119密度に対する影響は、病変のない対照レベルまで逆転しませんでした（補足図S4）。 私たちが現在検証している仮説は、CBDが前炎症性ミクログリア種の相対集団を抗炎症性ミクログリア種にシフトさせる能力であるというものです。

CNS損傷からの回復における抗炎症性ミクログリアサブタイプおよび他の骨髄細胞28の重要な機能には、シナプス密度の保存が含まれる53。 CBD による潜在的な保護/シナプス密度の促進は、PSD95 とシナプス前グルタミン酸作動性マーカー VGLUT2 の共局在を測定することによってテストされました (領域 X および RA への HVC 投射はグルタミン酸作動性であることに注意してください 54)。 予想通り、病変のない半球と比較して、HVC微小病変は領域自体内、およびその投影ターゲット内の密度が減少しているように見えました（図7および10b、変性の第二銅-銀の証拠も参照してください[補足図S7]）。 あまり予想されていなかったが、CBDはVEH対照と比較して、損傷のない半球内のシナプスマーカーの共局在を増加させ、新規シナプス形成の促進を示唆した。 シナプス形成活性が追加のシナプト保護を伴うかどうかは未解決の問題のままです (図 7、8、9)。 CBD治療後に見られる発声障害の程度の減少は、歌の学習中に確立された回路の潜在的な保護を示唆しています。 新しいシナプスの確立を促進することが、感覚運動学習に依存した音声回復のCBD促進の根底にある可能性があります。

CBDが興奮性シナプスを保護するメカニズムは、シナプスのスケーリングを調節することによるものです。 この恒常性プロセスは、さまざまな励起状態下でのシナプス感度を支配します55。 シナプスのスケーリングは、BDNF、MSK1、Arc/Arg3.132,56 などのタンパク質とシグナル伝達経路の複雑なネットワークによって制御されています。 BDNF は MSK1 を活性化し、MSK1 は Arc/Arg3.131 の発現を変化させるように作用します。 Arc/Arg3.1 は、学習関連の可塑性と記憶の固定の恒常性保護に重要な方法で、興奮性 AMPA 受容体サブタイプのシナプス局在を直接調節します 57。 Arc/Arg3.1 活性は興奮性 AMPA 受容体の内部移行を増加させ、興奮性シナプス強度を低下させスケールダウンします。 この制御は興奮毒性から保護する可能性があるが、AMPA受容体の発現パターンが音声学習中に確立される歌回路の維持に重要である限り、Arc/Arg3.1の増加により、媒体で処理された鳥で観察される音声の混乱が生じる可能性がある。 CBD処理鳥で観察された音声破壊の程度の減少は、病変に関連した興奮毒性後のシナプススケーリングの減少によるものである可能性があります（CuAg染色から明らか、補足図S7）。

総合すると、我々の結果は、運動前皮質様領域への損傷後のCBD作用の強力な抗炎症メカニズムとシナプト保護メカニズムを実証しています。 この効能は、歌回路内の複数のホメオスタシス関連メカニズムの促進に関連しています。 将来の研究では、これらの効果と、以前に実証された学習依存の音声回復とが関連付けられる可能性があります。

特に明記しない限り、すべての材料と試薬は Sigma Aldrich または Thermo Fisher から購入しました。 植物由来の CBD (98% 以上) は、英国ケンブリッジの GW Research Ltd によって提供されました。 CBD の濃縮ストックは、窒素を散布した 100% ETOH を使用して調製し、-20 °C で保存しました。 次いで、ストックをビヒクル（２：１：１７、ＥＴＯＨ：Ａｌｋａｍｕｌｓ：ＰＢＳ）で希釈して、１０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤの注射用の懸濁液を生成した。 結果として得られたエタノール投与量は 0.33 mg/kg であり、キンカチョウが自発的に消費する量よりも低かった 58。 麻酔に使用されるイソフルラン (Pivetal、NDC 46,066-755-03) は、イーストカロライナ大学比較医学部から提供されました。

上記のように調製した CBD のストックを、隔膜付きの滅菌 5 ml バイアルに入れて 4 °C で保存しました。 新鮮なストックを少なくとも毎週調製した。 注射の場合、薬剤調製物を、30gaの針を備えた滅菌1ccインスリン注射器に充填した。 注射の朝、照明が消えている間に鳥を手で捕獲し、噴射ボトルで送達された少量の 70% ETOH で羽をマットにして胸筋注射部位を露出させた。 胸筋の 4 つの象限のうちの 1 つに 50 μl を注射し、繰り返しの治療によって引き起こされる潜在的な損傷を最小限に抑えるために毎日交代で行いました。

実験は8日間に及んだ。 大量の分布と長い排出半減期をもつ親油性薬物である CBD を定常状態レベルに近づけるために、外科的処置の前に 15 μl の IM 注射を毎日 6 回行いました 59。 ７日目に、トリに術前注射を与え、以下に詳述する方法に従って片側の微小病変手術を行った。 片側のHVC微小病変は、中断の大きさが予想通り減少したことを除いて、以前に使用された両側アプローチと一致する方法で発声を大幅に、しかし一時的に中断することに注意してください（補足図S1を参照）。 片側性HVC微小病変の最大の行動効果は、本実験に使用した時点である微小病変後24時間で観察されました。 8日目、鳥は午前中に術後CBD注射を受け、午後にRNA抽出、またはパラホルムアルデヒドで固定された脳組織の灌流および単離のために安楽死させられた。 すべての方法は、関連するガイドラインおよび規制に従って実行されました。

成鳥のオスのキンカチョウ (生後 90 日以上) を当社の飼育鳥小屋で飼育し、12/12 の明暗サイクルで 78 °F で維持しました。 雄は歌を生み出す能力があるため、もっぱら使用されました。 鳥は、標準的なフィンチケージ (9 インチ × 11 インチ × 17 インチ) に、自由に餌と水を与えて飼育されました。 記録室で行われた以前の実験と一致して、鳥は視覚的には隔離されていましたが、聴覚的には隔離されていませんでした12。 すべての動物手順はイーストカロライナ大学動物管理使用委員会によって承認されており（以下の倫理宣言を参照）、この研究は ARRIVE ガイドラインに従って実施および報告されました60。

動物への影響を軽減し、統計検出力を向上させるために、我々は元の両側微小病変モデル 12 を修正して、個々の被験者が独自の内部対照として機能できる片側アプローチを採用しました。 証拠が人間の言語の特徴と同様の側性化を示しているため、左半球をターゲットとした61。これは音声と鳥のさえずりの類似点をさらに示しています（また、初期の最適化実験では、左半球のHVC微小病変が右半球をターゲットとしたものよりも声質を大きく混乱させることが示唆されました。補足図S1を参照） ）。 両側性の修飾を除いて、微小病変は以前に記載されているように行われました12。 簡単に説明すると、MIDMARK VMS 麻酔システム (91,800,003 VMS) を使用して、最初に 3% イソフルラン (1.0 L/min の一定流量で酸素キャリアとともに気化) を使用して鳥に麻酔をかけました。 頭頂部と後頭部の羽を取り除き、外耳道に挿入された2本の金属棒とくちばしバーにくちばしを配置し​​た定位固定器具に鳥を固定しました。 ビークバーには、処置中にイソフルランを一定に送達するための 20 ゲージのチューブが取り付けられていました。 正中矢状洞の分岐点を定位固定ゼロとして使用した。 小さな開頭切開を左 HVC 上に配置しました (頭蓋骨切片を除去した後、イソフルランを 2% に下げました)。 左 HVC の約 8% の破壊では、定位ゼロから 2.4 mm と 2.8 mm の深さ 0.6 mm の 2 つの位置が標的とされました。 微小病変は 100 μA で 35 秒間作成されました。 損傷後、縫合前にイソフルランを 1% に下げました。 鳥は暖かい保育器で回復し、記録室に戻されました。 これらの方法は、2007 年に Thompson と Johnson によって最初に開発された方法から適応されたものであることに注意してください11。また、音声回復を改善するための CBD の有効性を実証した私たちの以前の研究 12 では、ここで採用された片側アプローチではなく、両側性病変モデルが使用されていることにも注意してください。 私たちは、改訂された側方病変法に従って音声の回復を改善するCBDの有効性を実証していないため、これは限界です。 したがって、CBDの有効性に関連すると私たちが特定したメカニズムは、音声回復の改善の以前の実証と因果関係はありません。

遺伝子発現実験は、治療群あたり 4 ～ 5 羽の成鳥のキンカチョウから得た 3 つの生物学的複製を用いて実施されました。 各動物について、無菌の RNAse フリーの直径 1 mm の生検パンチツールを使用して、各半球から 3 つの対象領域の脳組織を切除しました (損傷のない右を内部対照として使用し、損傷のある左を使用)。 RA; 画像の例を補足図S2に示します。 脳サンプルをTRIzol試薬(Invitrogen、15,596,026)中でホモジナイズし、クロロホルムを使用して分離し、イソプロパノールを使用して沈殿させた。 沈殿したRNAを洗浄し、RNaseを含まない水に再懸濁しました。 RNA の品質はゲル電気泳動によって確認されました。 iScript 合成キット (Bio-rad、1,708,890) を使用して、全 RNA (250 ng) を使用して cDNA を合成しました。 完了した反応液を、RNAse フリー水を使用して 3 回ずつ 5 倍に希釈しました。 PCRはSYBRグリーンスーパーミックス(Bio-Rad、1,725,271)を使用して実施した。 選択的増幅は融解曲線分析を使用して確認され、データは CFX Manager ソフトウェア (Bio-Rad) を使用してサイクル閾値 (Ct) 値として取得されました。 遺伝子発現は内因性対照 (GAPDH) に対して正規化し、ΔΔCt 法 62 を使用して損傷のない半球から変化倍数を決定しました。 プライマー配列と情報は補足表 S1 にあります。

成鳥の雄キンカチョウ (n = 3 ～ 5) に 6 日間薬物治療を施し、7 日目に微小損傷を与え、24 時間後に固定に 4% パラホルムアルデヒド、凍結保護に 30% スクロースを使用して経心臓灌流を実施しました。 固定した脳を正中線でブロックし、OCT 包埋培地に置き、2-メチルブタンとドライアイスのスラリーを使用して凍結し、-20 °C に保ったクライオスタットを使用して 10 μm に切片化しました。 各鳥の右半球と左半球の傍矢状切片を Superfrost Plus スライドにマウントし、-20 °C で保存しました。

スライドを 5% 正常ヤギ血清で 37 °C で 1 時間ブロックしました。 さまざまなタンパク質を標的とする一次抗体を 2% 正常ヤギ血清で希釈し、最適な濃度で使用しました。抗 IL-6、10 μg/ml (Biomatik、CAU30440)。 抗 IL-1B、10 μg/ml (Mybiosource、MBS 2,090,494)。 抗 IL-10、1:100 (BIOSS、AGO7251283); 抗 PSD95、1:50 (サンタクルーズ、SC-32291)。 抗小胞性 GLUT2 (VGLUT2) 1:500 (細胞シグナル伝達、715,555)。 抗 TMEM119、1:100 (アブカム、AB185337)。 抗リン酸化 NRF2 (pNRF2)、1:200 (アブカム、AB76026)。 および核対比染色 Hoechst、1:10,000 (Thermo Fisher Scientific、H3570)。 一次抗体の特異性はウェスタンブロッティングによって検証され、その画像は補足図S6にまとめられています。 すべての一次抗体を 4 °C で一晩インキュベートしました。 翌日、スライドをPBSで洗浄し、2%正常ヤギ血清で希釈した対応する二次抗体中で37℃で1時間インキュベートしました。 二次抗体は、Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス (A32723)、Alexa Fluor 647 ヤギ抗マウス (A32728)、Alexa Fluor 647 ヤギ抗ウサギ (A32733) でした。 二次抗体中で１時間インキュベートした後、スライドをＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄し、続いてヘキスト核対比染色した。 4回目の最後の洗浄後、ダイヤモンド退色防止封入剤(Invitrogen、P36961)を使用してカバースリップをスライド上に配置した。 対照反応は、二次抗体の有意な非特異的結合の欠如を示すために、一次抗体を使用せずに行われました（図 S8 を参照）。

ゼブラフィンチ組織で使用される一次抗体の特異性を決定するために、ウェスタンブロット分析が行われました（補足の図6を参照）。 各ブロットについて、タンパク質サンプルを、プロテアーゼ阻害剤 (Thermo、A32953) を含む RIPA 溶解および抽出バッファー (Thermo、89,900) 中で均質化した脳組織 (Fisher Scientific、PowerGen 1000 S1) から調製しました。 均質化後、混合物を Rotomix 上で 4 °C で 2 時間撹拌しました。 次に、組織を 4 °C、16,000 g で 20 分間遠心分離し、ペレットを廃棄し、上清を収集しました。 プロテアーゼ阻害剤を含む溶解バッファーは、抽出ごとに新しく作成されました。 タンパク質濃度は、アッセイおよびその後の希釈のための希釈剤として溶解緩衝液を使用する、Pierce BCA アッセイ (Thermo Fisher Scientific、23,227) によって決定されました。

電気泳動分離では、4 µL のプレシジョン プラス デュアル カラー プロテイン ラダー (Bio-Rad、#1,610,374) を 10% Mini-PROTEAN TGX ゲル (Bio-Rad、#4,561,034) のレーン 1 にロードし、続いて 20 µg のキンカチョウをロードしました。レーン 2 の脳タンパク質 (4 × laemmli ローディングバッファーで 95 °C、5 分間変性)。電気泳動は一定の 100 V で 75 分間実行されました。 Trans-Blot Turbo System (Bio-Rad、1,704,150) を使用し、それぞれの分子量によって決定されたパラメーターを使用して、タンパク質をメタノール活性化 PVDF 膜に転写しました。 次いで、膜を濾過した0.1% TBST中の5% BSA中で37℃で3〜4時間ブロックした。 ブロッキング緩衝液を除去し、0.05% TBSTで希釈した7 mlの一次抗体を加え、ロッカー上で4℃で一晩インキュベートした。 抗体は最適化され、使用された濃度は次のとおりです: 抗 IL-6、10 μg/ml (Biomatik、CAU30440)。 抗 IL-1B、2 μg/ml (Mybiosource、MBS 2,090,494)。 抗 IL-10、1:1000 (BIOSS、bs-0698R-TR); 抗 PSD95、1:100 (サンタクルーズ、SC-32291)。 抗小胞性 GLUT2 (VGLUT2) 1:1000 (細胞シグナル伝達、715,555)。 抗 TMEM119、1:200 (アブカム、AB185337)。 抗リン酸化 NRF2 (pNRF2)、1:1000 (Abcam、AB76026)。 すべての希釈バッファーは使用前に新たに調製されました。 翌日、一次抗体を除去し、膜を0.1% TBSTで各10分間4回洗浄した。 4回目の洗浄後、メンブレンを適切な二次抗体中で37℃のロッカー上で1時間インキュベートしました。 二次抗体は、IRdye 680RD ヤギ抗ウサギ 1:10,000 (Licor、925 ～ 68,071) および IRdye 800CW ヤギ抗マウス 1:10,000 (Licor、925 ～ 32,210) でした。 インキュベーション後、二次抗体を除去し、膜を0.1% TBSTで各10分間4回洗浄しました。 洗浄後、Odyssey M Imager (Licor、M3350) を使用して画像をキャプチャしました。

スーパーオキシドアニオンは、以前に記載されたプロトコルに従って 5 μM ジヒドロエチジウム (DHE、Invitrogen、D11347) を介して検出されました 63。 DHE は細胞膜を自由に透過し、サイトゾルのスーパーオキシド (O2-) と反応して、DNA と結合すると赤色の蛍光を発するエチジウムを生成します。 この蛍光は定量化できます64。 簡単に説明すると、脳組織を迅速に解剖し、ドライアイス 2-メチルブタン スラリーを使用して OCT 化合物中で急速冷凍しました。 凍結ミクロトーム (Epredia Microm HM525 NX Cryostat) を使用して、10 µm 切片を切断し、Fisher Superfrost Plus 顕微鏡スライドにマウントし、PBS で希釈した 5 µM DHE 1 mL を各スライド上に静かにピペットで滴下し、37 °C で 30 分間インキュベートしました。光から保護し、PBS で 2 回洗浄し、画像化しました。

領域識別のための暗視野画像は、Image-Pro Plus ソフトウェア（バージョン 6.3）と 12.5 倍の暗視野コンデンサーを備えたオリンパス BX51 顕微鏡を使用して取得しました（補足図 S2）。 後で蛍光共焦点画像に重ね合わせるために、暗視野画像から関心領域の境界を追跡しました。 対象領域には、梗塞領域外の HVC、RA、および X 領域が含まれていました。3 つの対象領域すべての一部を含むセクションは、治療条件全体で均等に表現されることを保証するために特定されました。 蛍光画像は、40X (Plan-Apochromat/1.4 Oil DIC M27) および 10X 対物レンズ (EC Plan-Neofluar/0.30 M27) を備えた Zeiss レーザー走査顕微鏡 (LSM、700 Axio Observer) を使用して取得しました。 Zeiss ZEN Black イメージング ソフトウェアを使用して、5 つのスライスを使用して Z スタック画像をコンパイルし、Image J を使用して最大強度で重ね合わせた後に分析しました。

Image J ソフトウェアを使用して、各領域内のすべての画像に一貫して適用されるしきい値を使用して、8 ビットに変換された重ね合わせられた Z スタック画像を分析しました。 すべての CZI 形式の画像ファイルは、ZEN Black ソフトウェアからグレースケール tiff ファイルとしてエクスポートされ、最大強度 z 投影に統合されました。 IL-6、IL-1B、およびIL-10については、ソング領域ごとのヘキスト核染色に対する個々の染色の平均灰色値を、対照半球のパーセンテージとして定量した。 損傷のある半球と損傷のない半球の両方のサイトカイン発現の生の変換されていない相対蛍光測定が補足図S5に要約されていることに注意してください。 DHE の場合、平均グレー値を決定し、調査した各歌領域の外側の平均強度を使用して背景蛍光を補正しました (図 3B)。 対照半球のパーセンテージを使用してグループを比較しました (図 3C)。 平均補正全細胞蛍光 (CTCF) を使用して、一貫した円形領域 (円形直径 0.5 mm) を使用してバックグラウンドを除去しました: CTCF = 統合密度 - (平均歌領域強度 * 平均バックグラウンド強度)。 pNRF2 の核局在の分析では、色の閾値処理を使用して：（1）ヘキスト核染色と共局在する pNRF2 の領域、および（2）ヘキスト核染色の総領域を決定しました。 次に、pNRF2 核面積を総核面積のパーセンテージとして表し、グループ間で比較しました (図 4B)。 各領域内のミクログリアマーカーTMEM119の分析のために、TMEM119染色の平均グレー値をヘキスト染色核に対して正規化し、病変のない対照半球からの変化パーセントとして計算した(図6B)。 最後に、測定領域 (円直径 100 μm) あたりの VGLUT2 と PSD95 の共局在を使用して、グルタミン酸作動性シナプス密度を決定しました。

動物は、イーストカロライナ大学の施設内動物管理使用委員会 (ECU-IACUC) によって承認されたプロトコールに従って使用されました。 ECU-IACUC は、動物福祉法 (#55-R-0010) に基づいて登録された研究施設を監督しており、実験動物福祉局 D16-00,294 によって承認された動物福祉保証声明を持っています。 さらに、ECU は実験動物管理評価認定協会 (AAALAC) による完全な認定を継続しています。 動物、特に成人のオスのキンカチョウを対象としたこの研究は、実験の計画と承認された研究の実施、すべての情報が利用可能で簡単にアクセスできることを確認するための原稿の執筆とレビューを含むがこれらに限定されない、すべての ARRIVE ガイドライン 60 に従っていることが確認されました。

すべての組織学的データ、行動データ、および遺伝子発現データについて、GraphPad Prism 9.2.0 を使用して統計分析を実行しました。 データは平均値±SEMとして表されます。 混合モデル ANOVA とそれに続く Sidak の事後分析を使用して統計分析を実行し、グループ間の差異を特定しました。 p 値 ≤ 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。 統計結果は本文および図の凡例に示されています。

現在の研究で使用されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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私たちの原稿を思慮深くレビューし、神経炎症関連の専門知識を惜しみなく共有してくださった Alessandro Didonna 博士に感謝します。 また、Srinivas Sriramula 博士、Alexis Papariello 博士、Cindy Kukoly、Michelle Cobb からの技術的および方法論的なアドバイスにも感謝します。 この研究は、GW Pharmaceuticals とイーストカロライナ大学ブロディ医学部の薬理学・毒物学教室から一部資金提供を受けました。

イーストカロライナ大学ブロディ医学部薬理学・毒性学科、グリーンビル、ノースカロライナ州、27834、米国

マーク・トリプソン & ケン・ソーダーストロム

イーストカロライナ大学、イーストカロライナ糖尿病・肥満研究所、ブロディ医学部、解剖学および細胞生物学部、グリーンビル、ノースカロライナ州、27834、米国

カレン・リトワ

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MT、KS、KL は実験を概念化し、計画し、データを分析し、原稿の改訂を支援しました。 MT は実験を実行し、原稿を作成しました。 著者全員がこのレポートを読み、多大な貢献をしました。

ケン・ソーダーストロームへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

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受信日: 2023 年 2 月 9 日

受理日: 2023 年 5 月 10 日

公開日: 2023 年 5 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34924-z

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